密度梯度離心機(jī)在實(shí)驗(yàn)中時(shí)如何進(jìn)行操作的？

　　用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。密度梯度離心常用的介質(zhì)為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖。

 

　　分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求：

　　1、能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時(shí)，粘度不高；

　　2、PH中性或易調(diào)為中性；

　　3、濃度大時(shí)滲透壓不大；

　　4、對細(xì)胞無毒。

 

　　密度梯度離心機(jī)的操作過程如下：

　　1、將收集的組織或臟器或其他,用玻璃勻漿器充分研磨后制成懸液,經(jīng)反復(fù)凍融3次后,置-20℃冰箱中,備用。

　　2、先以5000g離心15分鐘后，獲取上清夜，然后再20000g高速離心30分鐘后取上清夜。

　　3、接著10萬g超速離心2h，將沉淀用少量STE溶解。

　　4、先在超速離心管中加入5-8mL的第3步所獲取的含病毒樣品的溶解液，然后在離心管中依次加入30%,45%,60%的蔗糖,加的時(shí)候是用長針頭從底部往上加的。11萬g離心2.5h,發(fā)現(xiàn)在30%與45%以及45%與60%之間都有一條明亮的帶，用長針頭將兩條不同部位的帶都吸取出來，分別收集到不同的瓶內(nèi)。

　　5、去蔗糖；用STE緩沖液適量稀釋純化的病毒，然后11萬g離心3h,用少量STE緩沖液把沉淀懸起，即后獲得了純化的病毒。-20度凍純備用，用時(shí)可用分光光度計(jì)測定其病毒含量。

 

　　密度梯度離心機(jī)的注意事項(xiàng)：

　　離心前將樣品小心鋪放在密度梯度溶液表面，離心形成區(qū)帶。離心后不同大小、不同形狀、有一定沉降系數(shù)差異的顆粒在密度梯度液中形成若干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。再通過虹吸、穿刺或切割離心管的方法將不同區(qū)帶中的顆粒分開收集，得到所需的物質(zhì)。

　　1、梯度介質(zhì)應(yīng)具備足夠大的溶解度，以形成所需的密度梯度范圍。

　　2、梯度介質(zhì)不會與樣品中的組分發(fā)生反應(yīng)。

　　3、梯度介質(zhì)也不會引起樣品中組分的凝集、變性或失活。

　　4、若離心時(shí)間過長由于顆粒的擴(kuò)散作用，會使區(qū)帶越來越寬。為此，應(yīng)適當(dāng)增大離心力、縮短離心時(shí)間，可以減少由于擴(kuò)散而導(dǎo)致的區(qū)帶擴(kuò)寬現(xiàn)象。